浙江大学医学院附属第二医院  胡新央

心肌梗死是导致心肌组织损伤的首要病因，药物、介入治疗虽明显降低了急性期的死亡率，但不能修复坏死心肌和有效延缓心肌梗死后左室重构，仍有相当部分病人出现心力衰竭。干细胞治疗已成为心肌梗死后心力衰竭治疗新的手段。大量的基础研究和初步的临床试验已显示了MSCs移植治疗缺血性心肌病的安全性和可行性。但移植后存活率低导致的移植疗效不理想一直是限制干细胞临床应用的瓶颈问题，因此，提高干细胞移植后存活和移植疗效是干细胞治疗领域亟待加以解决的关键科学问题。

我们从干细胞定居的胎盘和骨髓腔都是低氧环境得到启发，提出假设“移植前对干细胞进行低氧预处理能提高干细胞的存活能力和移植疗效”。通过反复摸索不同的氧浓度和时间，最终确定0.5%的氧浓度培养24小时不但不会增加MSCs的凋亡，反而能激活NF-κB通路，上调Bcl-2、Bcl-xl等抗凋亡蛋白，下调caspase-3促凋亡蛋白，进而提高干细胞在体内的存活能力。在大鼠心肌梗死动物模型上通过心肌内注射MSCs后，发现与常规培养的MSCs（N-MSC）相比，低氧预处理后的MSCs（H-MSC）有更强的抗凋亡能力，显著促进血管新生，能进一步缩小心梗面积，促进心肌组织修复，改善心功能。

因此，我们的上述动物实验结果表明了低氧预处理能提高MSCs的自分泌功能从而促进迁移、存活，改善心功能。由于低氧预处理作用时间较短，因此发生致肿瘤风险的可能性极小，且操作简单，在临床应用上相对较方便，是提高干细胞移植疗效安全有效的手段，但是低氧预处理增强干细胞修复心肌能力的分子机制尚不明确且临床上关于其有效性和安全性的数据尚缺乏。

为了揭示低氧预处理提高MSCs移植疗效的关键分子机制，我们通过基因芯片比较了H-MSC和N-MSC的基因表达谱，发现低氧预处理后上调最明显的是瘦素基因（leptin），与N-MSC相比，H-MSC瘦素基因表达上调55倍以上，RT-PCR及Western blot进一步证实H-MSC中的瘦素明显上调。上述发现充分提示瘦素上调极可能是低氧预处理MSC修复心肌能力增强的重要因素。为了证实这一点， 我们分别从WT、ob/ob、db/db小鼠分离出骨髓MSC，通过体内外实验研究了瘦素在低氧预处理提高MSC移植疗效中的作用。体内外实验均显示来源于野生型小鼠的MSCWT低氧预处理后迁移、存活能力显著提高，而低氧预处理的MSCob/ob及MSCdb/db（H-ob/ob，H-db/db）相对于常氧处理的MSCob/ob及MSCdb/db（N-ob/ob，N-db/db），其迁移、存活能力无显著改善。同时，MSCWT经低氧预处理后能明显提高心肌保护作用，减少心肌细胞凋亡，而MSCob/ob虽然与对照组相比有保护作用，但和MSCWT组相比，共培养的保护作用明显减弱。分别将常氧或低氧预处理后的MSCWT，MSCob/ob及MSCdb/db移植入小鼠心肌梗死模型内，28天后心超、血流动力学、Masson染色检查发现与PBS对照组相比，低氧预处理的MSCWT移植组显著缩小左室舒张末期直径（LV EDD）及左室收缩末期直径（LV ESD），提高左室射血分数（EF）和短轴缩短率（FS），而MSCob/ob，MSCdb/db无论常氧处理还是缺氧处理对心功能和心梗面积都无明显改善。进而我们对瘦素的信号通路进行研究，发现低氧预处理能提高MSCWT的STAT3磷酸化水平，并能提高CXCR4的表达，而MSCob/ob无论在常氧还是缺氧条件下，其CXCR4在mRNA及蛋白水平上无明显差异。上述结果提示，缺氧可能通过HIF-1α上调瘦素表达，瘦素可能通过激活STAT3的磷酸化，增强MSC表面的CXCR4表达，进而提高MSC的迁移及存活能力，增强心肌保护作用，最后促进心功能恢复，疤痕面积减少。

上述动物实验证实了低氧预处理能提高骨髓干细胞的存活、迁移、旁分泌能力，并最终改善心功能、缩小心梗面积，提高干细胞修复梗死心肌的潜能。但是目前为止并没有关于低氧预处理骨髓干细胞移植治疗急性心肌梗死患者的有效性和安全性的数据。CHINA-AMI的研究目的是评价经冠脉内注射自体低氧预处理骨髓干细（hypoxia-preconditioned bone marrow cells, HP-BMCs）治疗急性ST段抬高的心肌梗死（STEMI）患者的安全性与可行性。

CHINA-AMI是前瞻性随机对照双盲研究。研究一级终点是细胞治疗的安全性评价，主要指30天内MACE事件发生率包括死亡、再次心梗、心衰住院、血流动力学异常的或持续性室性心动过速，二级安全性终点是12个月内MACE事件发生率；研究二级终点是有效性评价，包括6月，12月通过心超评价LVEF、左室舒张末容积（LVEDV）、左室收缩末容积（LVESV）的改变和通过SPECT评价心肌灌注缺损率改变情况。

22位急性STEMI患者接受急诊血运重建后以1:1随机分为低氧预处理骨髓干细胞移植（HP-BMCs，n=11）和常氧培养骨髓干细胞治疗组（normoxia bone marrow cells, N-BMCs，n=11），另有14名患者接受标准治疗作为对照组。三组患者在治疗后30天和一年内MACE的发生率无统计学差异，说明低氧预处理骨髓干细胞移植是安全的。心超评价显示LVEF在三组之间没有统计学差异，但对照组6月时LVEF较基线时比较有明显下降，而低氧预处理骨髓干细胞移植组LVEF有升高的趋势；有意义的是，与N-BMSs组或对照组相比，移植后6，12个月，HP-BMCs组患者的舒张末期容积和收缩末容积都明显缩小（P<0.05），说明低氧预处理骨髓干细胞移植可能能有效延缓左室重构。心肌SPECT扫描显示，N-BMSs组和HP-BMCs组患者的心肌灌注缺损率较基线值下降（P<0.05），但三组间比较并无显著差异。本研究首次证实了经冠脉内注射低氧预处理自体骨髓干细胞治疗急性心肌梗死是安全且可行的，并且低氧预处理自体骨髓干细胞可能能更有效地延缓左室重构。

我们通过动物实验、机制研究以及临床试验，证实了低氧预处理骨髓间充质干细胞能提高移植细胞存活率，并提高移植疗效，其中leptin介导的信号通路是其提高疗效的重要机制，为干细胞治疗心肌梗死的疗效优化提供了新的方法和思路。