复旦大学附属中山医院

上海市心血管病研究所

邹云增

心血管疾病已经成为威胁人类健康的第一杀手，而心肌梗塞是导致心血管病死亡的最主要疾病之一。但由于成年心肌细胞通常不能再生，心脏移植成为治疗重型心肌坏死的惟一有效途径。而由于供体心脏的严重匮乏，致使成千上万的心肌梗塞患者在等待中死亡。20 世纪90 年代以来，科学家先后应用啮齿类和猪胚胎、胎儿和新生儿心肌细胞、胎儿平滑肌细胞、AT-1 肿瘤细胞、成人与胎儿心肌细胞、成人自体心室心肌细胞、真皮成纤维细胞等作供体细胞进行细胞移植治疗心肌梗塞的动物模型试验，已取得了较好的进展。移植的细胞具有舒缩功能，能引起心血管再生。因此，移植心肌细胞是治疗重型心肌坏死的一个替代途径。然而，由于流产胎儿心肌细胞的伦理学问题以及上述其他细胞的免疫排斥问题，使得能用于细胞移植治疗心肌梗塞的理想种子细胞很少。随着人类和动物胚胎干细胞成功建系及其体外向心肌细胞诱导分化技术和骨髓、皮肤、神经、心脏自身等组织干细胞向心肌细胞转分化技术的日渐成熟，干细胞为治疗心血管疾病提供了新的种子细胞来源和思路。

诱导多能性干细胞( i P S细胞) 是指通过特定基因的表达将完全分化的成年细胞重新编程为类似胚胎状态的全能性或多能性的细胞。2 0 0 6年，日本的 Y a m a n a k a研究小组首次报道利用逆转录病毒将 4种转录因子组合导入已分化的小鼠纤维母细胞中获得 i P S细胞。由于 i P S细胞绕开了胚胎干细胞( E S ) 研究一直面临的伦理和法律等诸多障碍而受到科学家们的青睐，引发了研究热潮。i P S技术被认为是干细胞研究领域的一个里程碑式的突破，同时被认为具有巨大的潜在应用价值。

但要真正应用于临床治疗心血管疾病还需先解决以下几个问题:(1)研究心脏分化的机制,使能高效地分化为心肌细胞;目前,人类向心肌细胞诱导分化率较低,仅具有早期心肌细胞的结构和特性,而且尚未建立有效的筛选纯化技术。(2)成瘤性的危险,需要进行定向分化。在植入体内有可能形成畸胎瘤,因此需要建立人类向心肌细胞稳定的定向分化技术体系,并尽可能筛选纯化心肌细胞,以避免直接用进行细胞替代治疗可能引发肿瘤的危险。

在寻找影响干细胞分化的新因素的过程中，我们发现了Nap1l1参与了干细胞向心肌细胞的分化过程。Nap1 (Nucleosome assembly protein 1)广泛存在于酵母、植物及各种动物中, 是核心组蛋白H2A/H2B的分子伴侣, 能够在蛋白激酶2(CK2)的调节下于细胞核和细胞质之间穿梭, 在组蛋白代谢、动植物细胞生长及分化和组织建构等方面发挥多种重要的功能。但是Nap1l1在干细胞中发挥的作用还不清楚。

我们系统地研究了Nap1l1在控制干细胞增殖，细胞凋亡，细胞周期及维持多能性中的作用。结果显示，下调nap1l1的表达导致细胞增殖能力降低，而上调Nap1l1的表达显示了相反的结果。此外，上调和下调 Nap1l1的表达不影响iPS的多能性。因此，Nap1l1在iPS自我更新中起到了一定作用。此外，Nap1l1可能通过调节多种基因和途径来调控iPS细胞的自我更新。有研究显示Notch信号通道在胚胎干细胞自我更新中发挥了作用，因此，我们观察了Nap1l1对Notch信号通道的影响。实验结果显示，抑制Nap1l1的表达降低了Notch胞内活化段-NICD的表达，同时也降低了Notch信号通道下游目的基因的表达，说明Nap1l1参与了Notch信号通道。

虽然iPS细胞为心血管研究尤其是心肌再生提供了新的机会，但将iPS细胞真正应用于临床还存在若干问题，其中之一就是iPS细胞向心肌细胞的分化率很低。因此，尙需进一步明确iPS细胞向心肌细胞定向分化的机制以提高分化率。在iPS细胞的分化过程中， Nap1l1 在分化早期表达逐渐上调，而在分化晚期，Nap1l1的表达则迅速降低，提示Nap1l1在iPS细胞向心肌细胞分化的过程中很可能发挥着一定的作用。

为更好的研究Nap1l1在iPS细胞心肌分化中扮演的角色，我们建立了Nap1l1抑制和过表达细胞系，观察Nap1l1表达改变后心肌细胞分化的变化。首先，我们观察到Nap1l1表达抑制后EB的跳动率比对照组增强，且在在跳动率最高的第15天，alpha-MHC的阳性面积是对照组的两倍。通过检测心肌结构性基因alpha-MHC, belta-MHC, cTnT和Nppb在分化后期的表达，发现下调Nap1l1表达提高了这些基因的表达。综合这些结果，提示Nap1l1抑制后促进iPS细胞向心肌细胞的分化。

因为心肌细胞由中胚层分化而来，为进一步探讨Nap1l1在iPS细胞分化中作用，我们检测了中胚层的分化情况。Brachyury, Mesp1和Isl是中胚层早期分化标志基因，Brachyury和Mesp1在分化第四天出现表达高峰，Isl在分化第2至第六天表达逐渐升高。在抑制Nap1l1表达后，这三种基因的表达在相应的分化天数比对照组都是显著性升高。而在过表达Nap1l1后，Brachyury, Mesp1和Isl的表达受到抑制。Nkx2.5, Mef2c和Tbx5是心肌分化早期转录因子，在抑制Nap1l1后，这些早期转录因子同时表达升高，说明Nap1l1表达下调促进了早期心肌的分化。中胚层不仅可以分化为心肌细胞，同时也可以分化为内皮细胞和平滑肌细胞，在本研究中，我们不仅观察到抑制Nap1l1的表达促进了iPS细胞向心肌细胞的分化，也增强了向内皮细胞和平滑肌细胞的分化，因此Nap1l1并非特异性的作用于心肌细胞的分化。

抑制Nap1l1表达分化而来的心肌细胞能够表达心肌特异性结构蛋白alpha-MHC, cTnT和cTnI,同时也表达缝隙连接蛋白-connexin43。在去甲肾上腺素和氨甲酰胆碱刺激下，Nap1l1的抑制并没有改变分化而来的心肌细胞对两者的反应。这些结构表明，Nap1l1的抑制没有影响分化出的心肌细胞的结构和功能特征。

总之，我们的研究表明Na1l1的抑制能够促进iPS细胞向心肌细胞的分化，而其中的机制还有待深入研究。